MORFOLOGI DAN PEWARNAAN BAKTERI

A.      LATAR BELAKANG

            Bakteri berasal dari kata “bakterion” (bahasa Yunani) yang artinya tongkat atau benang. Saat ini nama itu dipakai untuk menyebut sekelompok mikroorganisme yang bersel satu, tidak berklorofil (meskipun ada kecualinya), berkembang biak dengan pembelahan diri, serta demikian kecilnya sehingga hanya tampak dengan menggunakan mikroskop.

            Apabila kita ingin mengetahui sifat-sifat morfologi bakteri, maka bekteri dapat diperiksa dalam keadaan hidup maupun dalam keadaan mati. Pemerikasaan morfologi ini perlu untuk mengenal nama bakteri dan sifat-sifat fisiologi yang merupakan faktor penentu dalam mengenal nama spesiesnya.

            Pada rangkaian pengamatan bakteri, terdapat cara untuk mengetahui sifat-sifat morfologi tersebut yaitu dengan pewarnaan bakteri. Larutan pewana tidak dapat langsung masuk ke dalam sel hidup. Oleh karena itu, sel biasanya di bunuh dahulu sebelum dilakukan pewarnaan. Sel yang mati akan menyerap dan mempertahankan pewarna. Cara umum untuk membunuh sel adalah dengan fiksasi panas. Sel diapuskan pada gelas objek sehingga diperoleh lapisan tipis. Preparat kemudian dipanaskan pelahan-lahan untuk membunuh sel.

       Metode mewarnai atau mengecat preparat itu ada banyak sekali antara lain dengan pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan mikroorganisme dengan menggunakan satu jenis zat saja. Kemudian ada pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Selanjutnya ada pewarnaan acid-fast. Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan bakteri yang tahan asam dengan yang tidak tahan asam.

            Kemudian pewarnaan gram. Pada tahun 1884, seorang ahli histology dan bakteriologiawan dari Denmark, Christian Gram secara kebetulan menemukan prosedur pewarnaan Gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan secara umum menjadi dua kelompok besar, yaitu pertama, organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu iodium sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap/ungu), disebut “Gram positif”. Kedua, organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna bandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda), disebut “Gram negatif”.

            Pada perkembangan ilmu pangan, pengetahuan akan bakteri sangat dibutuhkan terutama dalam identifikasi jenis bakteri yang berkaitan dengan pangan. Misalnya pemanfaatan bakteri yanag menguntungkan sehingga banyak digunakan dalam industri makanan atau proses pengubahan suatu zat dalam makanan.

B.   TUJUAN

Tujuan dari praktikum acara Morfologi dan Pewarnaan Bakteri adalah untuk mempelajari morfologi bakteri dan membedakan jenis bakteri dengan cara pewarnaan bakteri menggunakan metode pewarnaan negatif, Gram, dan  acid-fast.

C.  TINJAUAN PUSTAKA

Ziehl-Neelsen adalah metode yang paling umum digunakan. Dinding sel organisme mikrobakteri mengandung kompleks lipid dikenal sebagai hidroksi karboksilat asam, phitiocerols dan polimetil asam. Kompleks lainnya lipid dan
glycolipids telah diisolasi. Karboksilat hidroksi asam yang memiliki sifat tahan luntur asam dan lainnya menyajikan sebuah penghalang untuk pewarna masuk serta elusi. Metode Ziehl-Neelsen ini adalah dengan menambahkan fenol, agen lipofilik untuk larutan dari fuchsin dasar oleh pemanasan dan memperpanjang waktu pewarnaan (Raoul, 2009).

Pencarian untuk kecepatan dan keberhasilan telah menghasilkan beberapa modifikasi untuk menyederhanakan metode pewarnaan ZN. Namun, tidak satupun yang telah memperoleh penerimaan yang luas kecuali untuk metode pewarnaan dingin. Dalam studi ini, pewarnaan ZN menggunakan 0,3% fuchsin dasar yang ditemukan sensitif dan spesifik untuk yang menggunakan 1% fuchsin dasar. Menggunakan reagen ini dapat menghindari pemborosan fuchsin dasar dan mengurangi biaya pewarnaan. Mengurangi konsentrasi dari fuchsin dasar di bawah 0,3%, bagaimanapun, ditemukan mempengaruhi sensitivitas ZN (Selvakumar, 2005).

            Secara garis besar berdasar pengecatan Gram, bakteri dikelompokkan menjadi 2, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri Gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna gram A yang mengandung kistal violet, sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah atau merah muda, karena warna ungu dapat dilunturkan kemudian mengikat cat Gram D sebagai warna kontras. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Pada bakteri Gram positif susunan lebih sederhana terdiri atas 2 lapis namun memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sementara pada dinding sel bakteri lebih kompleks terdiri atas 3 lapis namun lapisan peptidoglikan tipis (Juliantina, 2009).

            Bakteri Lactobacillus sp. ini termasuk Gram positif, tidak berspora, tidak motil oleh flagel peritrichous, fakultatif anaerob, kadang-kadang mikroaerofilik, sedikit tumbuh di udara tapi bagus pada keadaan di bawah tekanan oksigen rendah, dan beberapa anaerob pada isolasi. Bakteri yang mendekati genus ini mempunyai ciri-ciri morfologi sebagai berikut: warna koloni putih susu atau agak krem, bentuk koloni bulat dengan tepian seperti wol. Sel berbentuk batang dan biasanya tetap, berukuran 0,5-1,2 x 1,0-10,0 μm (Feliatra, 2004).

Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri adalah pewarnaan Gram. Dalam proses ini olesan bakteri terfiksasi dikenai larutan sebagai berikut : ungu kristal, larutan yodium, alcohol (bahan pemucat), dan safranin atau beberapa pewarna tandingan lain yang sesuai. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi 2 kelompok yaitu Gram positif mempertahankan zat pewarna ungu kristal dan karenanya tampak ungu tua. Kelompok lain, bakteri gram negatif, kehilangan ungu kristal ketika dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi pewarna tandingan dengan merah safranin, tampak bewarna merah (Pelczar, 1986).

Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati dengan mikroskop. Bakteri Gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam dan membran luarnya. Banyak spesies bakteri Gram negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel Gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Anonim^a, 2011).

Gram negatif yang paling terkenal adalah Veillonella alcalescens (dahulu Micrococcus lactilyticus) dan Megasphaera (dahulu Pepto streptococus). Kedua-duanya tidak mampu untuk meragikan karbohidrat. V. alcalescens ditemukan dalam ludah manusia dan hewan, dan juga perut besar hewan pemamah biak. Bakteri ini meragikan asam-asam organik menjadi propionat, asetat, CO₂, H₂ (Schlegel, 1994).

E.coli adalah suatu bakteri Gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerobic fakultatif, dan mempunyai flagella peritrikat. E.coli dibedakan atas sifat scrologinya berdasarkan antigen O (somatik), K (kapsul), H(flagella). Medium selektif yang dapat digunakan untuk mengisolasi E.coli misalnya DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) Agar atau MacConkey Agar. Koloni E.coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan dikelilingi oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile. E.coli akan menfermentasikan laktosa dalam medium menjadi asam, sehingga mengakibatkan terjadinya pengendapan bile dan penyerapan indikator merah netral (Fardianz,1990).

Lactobacillus adalah suatu bakteri berbentuk batang, bervariasi dari panjang dan ramping sampai kokobaksilus pendek. Pembentukan rantai umum dijumpai, terutama pada fase pertumbuhan logaritma lanjut. Tidak membentuk spora. Gram positif berubah menjadi gram negatif dengan bertambahnya umur dan derajat keasaman. Beberapa galur memperlihatkan tubuh-tubuh bipolar, granulasi internal atau penampilan seperti batang dengan reaksi gram atau pewarna biru metilen (Pelczar, 1988).

Pewarnaan negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang biasa dilakukan untuk membedakan spesimen kecil dengan cairan optiknya.
Untuk mikroskop medan terang, pewarnaan negatif biasanya menggunakan cairan hitam misal nigrosin. Spesimen seperti bakteri dalam cairan disebar dalam preparat kaca yang dicampur dengan pewarna negatif dan dibiarkan kering. Ketika diamati dengan mikroskop, bakteri atau kadang sporanya terlihat bersinar dengan latar belakang yang gelap. Pewarnaan negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin (Anonim^b, 2011).

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang pada pengecatan Ziehl-Neelsen (ZN) tetap mengikat warna pertama, tidak luntur oleh asam dan alkohol, sehingga tidak mampu mengikat warna kedua. Bakteri tersebut ketika diamati dibawah mikroskop tampak berwarna merah dengan warna dasar biru muda. Terdapat lebih dari 50 spesies Mycobacterium, antara lain banyak yang merupakan saprofit (Anonim^c,2011).

Prosedur pewarnaan yang umum digunakan pada masa kini yaitu pewarna Ziehl – Neelsen, prosedur ini menggunakan pewarna utama dengan pemanasan, dan biru metilena loeffler sebagai warna tandingan. Alkohol-asam merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol aseton yang banyak digunakan dalam pewarnaan gram. Pada kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Pada bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam (Hadioetomo, 1990)

D.  METODOLOGI

1          1.      Alat

a.    Gelas objek

b.    Gelas penutup

c.    Batang gelas

d.   Jarum oose

e.    Pipet tetes

f.     Rak tabung reaksi

g.    Bunsen spirtus

h.    Label dan tissue

i.      Mikroskop cahaya

2.      Bahan

a.    Biakan murni Lactobacillus achidophilus, Escherichia coli dan Lactococcus sp.

b.    Larutan cat nigrosin

c.    Aquades

d.   Alkohol 70%

e.    Larutan cat Ziehl Neelsen carbol fuchsin

f.     Larutan peluntur alkohol asam

g.    Larutan penutup Loeffler methylen blue

h.    Larutan cat Huker’s crystal violet

i.      Larutan mordan Lugol’s iodine

j.      Larutan peluntur alkohol-aseton

k.    Larutan Safranin

E.  Hasil Pengamatan dan Pembahasan

                        Pewarnaan Gram termasuk pewarnaan differensial karena dapat digunakan untuk membedakan bakteri dalam dua kelompok besar yaitu Gram positif dan Gram negatif. Pada praktikum ini digunakan bakteri L. Achidophilus, E. coli, Lactococcus sp.

              Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri Gram positif mengandung protein dan Gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif sedangkan pada bakteri Gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

              Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel  dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalahfase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV (warna utama) iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada Gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa spesies yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Pembahasan

              Pewarnaan acid-fast digunakan untuk membedakan antara bakteri tahan asam dan bakteri tidak tahan asam. Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses  sehingga menghasilkan warna merah.

              Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru. Bakteri tahan asam akan mempertahankan warna pertama yang diberikan. Hasil yang didapat adalah terdapatnya bakteri tahan asam. Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri.

Pembahasan

              Pewarnaan negatif merupakan pewarnaan dengan mencampurkan sampel dengan zat warna dan disebarkan menjadi lapisan tipis. Zat warna atau cat yang digunakan memiliki pengaruh yang lemah terhadap sel mikroorganisme. Pewarnaan ini dinamakan pengecatan negatif karena sel tidak diwarnai dan dibuat menjadi kasat mata karena latar belakang yang gelap.

              Pada praktikum ini digunakan bakteri Lactobacillus achidophilus. Pewarnaan negatif ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

Pewarnaan negatif atau peawarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu sel menjadi tidak berwarna. Untuk pengamatan menggunakan mikroskop elektron transmisi, kemampuan optis elektron berhubungan dengan nomor atom. Beberapa pewarna negatif seperti ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate, phosphotungstic acid dan auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elekron dengan baik dan menyerap zat biologi dengan baik. Struktur yang dapat diamati dengan pewarnaan negatif lebih sedikit dari pada dengan pewarnaan biasa. Cara ini biasa digunakan untuk melihat virus, bakteri, flagel bakteri, struktur protein atau gabungan protein biologi membran yang memiliki pancaran elektron dengan kekuatan rendah. Pewarnaan negatif pada mikroskop cahaya atau mikroskop elektron tidak menimbulkan penularan mikroorganisme. Walau demikian keamanan harus tetap diperhatikan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif memungkinkan organisme terlihat transparan dan tampak jelas diantara medan yang gelap karena pewarna tersebut tidak menembus mikroorganisme. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini juga berguna untuk bakteri-bakteri tertentu yang sukar diwarnai.

F.    Kesimpulan

Kesimpulan yang didapatkan dari praktikum Morfologi dan Pewarnaan Bakteri ini antara lain:

a.    Bakteri Gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

b.    Kelompok bakteri yang merupakan Gram positif adalah L. Achidophyllus dan Lactococcus sp. Sedangkan kelompok bakteri yang merupakan Gram negatif adalah E. coli.

c.    Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri Gram negatif karena akan kehilangan cat utama setelah tahap dekolorasi sedangkan pada bakteri Gram positif menyebabkan sel menjadi berwarna ungu karena mengikat kuat cat utama dan tidak dapat dilunturkan oleh bahan peluntur.

d.   Pewarnaan menggunakan larutan Ziehl-Neelsen akan menampakkan bakteri tahan asam yang berwarna merah dengan latar berwarna biru karena tahan terhadap pencucian dengan asam dan alkohol sehingga mempertahankan warna pertama yang diberikan. Sedangkan bakteri tidak tahan asam akan tampak berwarna biru karena cat pertama dilunturkan oleh asam dan alkohol kemudian mengikat cat kedua.

e.    Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

f.     Pewarnaan negatif atau pewarna asam dapat terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif.

g.    Beberapa pewarna negatif seperti ammonium molybdate, uranil acetate, uranyl foemate, phosphotungstic acid dan auroglucotnionate dipilih karena mampu menyebarkan elektron dengan baik dan menyerap zat biologi dengan baik.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim^a. 2011. Gram Negatif. http://www.wikipedia.com. Diakses pada tanggal  2 Mei 2011 pukul 16.00 WIB.

Anonim^b. 2011. Pewarnaan Negatif http://capuholic.blogspot.com/2010/02/  Diakses pada tanggal  2 Mei 2011 pukul 16.54 WIB.

Anonim^c. 2011. Bakteri Tahan Asam . http://my.opera.com/chanlightz/blog. Diakses pada tanggal  2 Mei 2011 pukul 17.12 WIB.

Feliatra, dkk. 2004. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Probiotik dari Ikan kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam upaya Efisiensi Pakan Ikan. Jurnal Natur Indonesia 6(2).

Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.

Fardianz, Srikandi. 1990. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Juliantina, Farida. 2009. Manfaat Sirih Merah sebagai Agen Anti Bakterial terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Jurnal Kedokteran dan Kesehatan Indonesia.

Pelczar, Michael J. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. UI press. Jakarta.

Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi 2. UI press. Jakarta.

Raoul, Da’si Kemgni, dkk. 2009. A Faster and saver staining technique for acid fast bacilli in resource-poor settting. Vol 1.(5), May.

Schlegel, Hans G.1994. Mikrobiologi Umum. UGM press. Yogyakarta.

Selvakumar, N, dkk. 2005.  Comparison of variants of carbol-fuchsin solution in Ziehl-Neelsen for detection of acid-fast bacilli. Int J Tuberc Dis 9(2). New Delhi, India.